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chig erfasst werden, je nach Struktur erwischt man unter Umständen nur die Großen, die klei- nen „Bodendecker“ bleiben unter den Wipfeln großer Konidienträger verborgen. Mit Entwicklung der Digital- und 3D-Mikro­ skopie ist diese Limitierung aufgehoben, sodass auch im Auflichtverfahren Vergrößerungen bis zu 2000fach digitalem Zoom möglich sind. Neben der Digitalmikroskopie kann heutzutage nicht mehr auf die Epifluoreszenzmikroskopie verzichtet werden. Das sind kombinierte Mikroskope, die in Hellfeld und Transmission mit weißem Licht die Präparate durchstrahlen, gleichzeitig aber über eine Halogenlichtquelle verfügen, die mittels Fil- terblöcken monochromatisches Licht ausstrahlen kann und damit wiederum als Auflichtmikroskope Vergrößerungen bis 1000fach ermöglichen. Mo- nochromatisches Licht ist notwendig, um Fluo- reszenz anzuregen, daher haben die Mikroskope ebenfalls Filterblöcke, um diese Anregungswel- lenlängen wieder auszufiltern, sodass nur das Fluoreszenzsignal abgebildet wird. Es leuchtet also im Bildfeld nur das auf, was entweder über ein natürliches Fluorochrom verfügt oder zuvor durch einen Fluoreszenzfarbstoff angefärbt oder wie es hier genannt wird, markiert bzw. gelabelt wurde. So ist Chlorophyll ein natürliches Fluoro- chrom, das eine typische kirschrote Fluoreszenz erzeugt, wenn es mit UV-Strahlung, blauem oder grünem Licht angeregt wird. Algen, Cyanobak- terien und grüne Bakterien, aber auch Pflan- zen leuchten daher ohne weitere Behandlung im Fluoreszenzmikroskop rot auf, wie im Bild 3 erkennbar. Mikroorganismen, die nicht über ein natürliches Fluorochrom verfügen, werden durch den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen zur Abbildung gebracht. Und hier gibt es eine Fülle an Möglichkeiten, nicht nur die Mikroor- ganismen an sich sichtbar zu machen, sondern darüber hinaus ihren Lebenszustand und sogar ihre Identität kultivierungsunabhängig nachzu- weisen. Diese Techniken ermöglichen erstaun- liche Einblicke in das Befallsgeschehen auch bei kompakten Proben wie Putzen oder Dämmstoffen ohne weitere Präparation, abgesehen vom Zusatz von Fluoreszenzfarbstoffen. Informationsgewinn Das Verfahren der 3D-Direktmikroskopie eignet sich insbesondere für die Erfassung von Oberflä- chen aber auch Querschnitten, um z. B. Befälle im Tiefenprofil oder mehrfaches Überstreichen sichtbar zu machen. Große Probenquerschnitte sind hierbei kein Problem, so ist ein sicherer Nachweis von Schäden, ihrem Ausmaß und be- teiligten Schimmelpilzen. Bakterien sind hier- bei nur eingeschränkt erkennbar. Auch wird es schwierig, sehr kleine und ungefärbte Sporen sichtbar zu machen, die eine genaue Identifi- zierung bis auf die Art ermöglichen, dazu müs- sen dann wieder klassische Präparate für die Transmissions-Lichtmikroskopie erstellt werden. Sehr kleine biologische Strukturen wie Sporen oder Bakterien sind wiederum mittels Epifluo- reszenzmikroskopie abbildbar. Dieses Nachweis- verfahren ist auch für Materialproben anwend- bar. Eine kleine Auswahl zeigt dazu Bild 3. Dazu markiert man mit einem DNA-Farbstoff alle vor- handenen Zellen, und zwar Pilze wie Bakterien. Gebräuchliche Farbstoffe sind hierbei in erster Linie DAPI, aber auch SYTO Gold oder Grün, Acri- dinorange oder Propidiumjodid. Eine Markierung zeigt hierbei alle vorhandenen Zellen an. Vor- teil des Verfahrens ist, dass alle vorhandenen Zellen unabhängig von ihrem Vitalitätszustand nachgewiesen werden können. Also auch nach einer Biozidbehandlung oder längeren Phasen A C B D Bild 2: Epifluoreszenzmikroskope sind Durchlichtmikroskope (Bild A), die zusätzlich mit einer Fluoreszenzein­ richtung versehen sind und so statt mit weißem Licht auch monochromatisch (UV, Blau, Grün) im Auflicht anregen können. Fluorochrome reagieren mit Fluoreszenz bzw. Lumineszenz wie Grünalgen auf Putz im Bild B. Am besten eignen sich für die Direktmikroskopie inverse Mikroskope (C) mit großem Probentisch, sodass auch große Oberflächen ohne weitere Präparation (D) untersucht werden können. Schützen & Erhalten · März 2018 · Seite 24 Fachbereiche Schimmelpilze A C B D Bild 3: Fungal lightning: Epifluoreszenz-Mikroskopie eröffnet einen neuen Kosmos: Alle Aufnahmen unter UV- Anregung: A – Aspergillus sp. auf einer Putzprobe, ungefärbt und 200fach, B – Cladosporium sp. ungefärbt auf Gipskarton, beide Proben können als eindeutig besiedelt/ starker Befall eingestuft werden. C und D: EPS- Dämmstoff nach Wasserschaden mit DAPI gefärbt (400fach), deutlich erkennbar sind die wie Fischeier leuch­ tenden Sporen vom Typ Aspergillus/ Penicillium spp. in C, in D sind neben dunklen ungefärbten Sporen kleine Bakterienbiofilme erkennbar. Diese Proben können als kontaminiert/ stark kontaminiert sowie leicht befallen mit Bakterien eingestuft werden.